Культивирование и очистка вирусов гриппа

Grypp_ru2

Существует несколько различных методов очистки вирусов гриппа. Описанный здесь метод постоянно используется в нашей лаборатории, а также, с небольшими модификациями, в некоторых других научных группах. Метод одинаково пригоден для очистки вируса, культивированного как на куриных эмбрионах, так ,и на монослойной культуре фибробластов куриного эмбриона (CEF). Кроме того, с помощью этого метода получают препараты вируса высокой степени чистоты с 40% выходом относительно исходного количества вирионов при очень небольшой потере инфекционное и гемагглютинирующей активности. В настоящее время описаны и другие методы очистки (в частности, с использованием для осаждения сульфата аммония), с помощью которых также получают вирусные препараты высокой чистоты, однако высокая ‘концентрация соли, используемая в этих методах, оказывает нежелательное действие на инфекционность вирионов. Необходимо отметить, что основное требование, предъявляемое к описанным здесь методикам, состояло в минимальном воздействии на инфекционность вируса.

В большинстве биохимических работ, выполненных на вирусах гриппа США, в качестве объекта исследования использовали штамм WSN. В Европе же внимание сосредоточилось на изучении FPV, другого штамма вируса гриппа А. Различия между этими двумя штаммами (в частности, в нуклеиновых кислотах и их репликации), вероятно, не особенно велики.

Штамм WSN обычно культивируется на первичной культуре фибробластов куриных эмбрионов (CEF). Для получения больших количеств вируса [порядка 5-Ю10—10-Ю10 бляшкообразующих единиц (БОЕ)] 40—60 сплошных монослоев инокулируются с вирусом с множественностью заражения приблизительно 5-Ю»"5 БОЕ на клетку. Монослои инкубируют при 37 °С в течение 40 ч в атмосфере 5% СО2 (Simpson, Hirst, 1961), и вирус выделяют из сулернатанта по методике, описанной далее. Для получения радиоактивно меченного вируса в систему непосредственно перед инкубацией при 37 °С добавляют нужные изотопы, обычно [3Н]-5-уридин (2— 5 МкКи/мл) или [3Н]-или,[14С]-аминокислоты (2—4мкКи/мл).

После обработки РНК-азой вирус наслаивают поверх 4 мл 30% сахарозы в буфере STE и центрифугируют в течение 1 ч при 145 000 g. К осадку добавляют буфер STE, смесь гомогенизируют для того, чтобы полностью ресуслендировать вирус, и центрифугируют для удаления дебриса на малой скорости. Сулернатант наслаивают на линейный градиент сахарозы (по 10 мл 30—60% сахарозы в буфере STE), покрытый слоем минерального масла (10 мл) и центрифугируют до равновесия в течение 17 ч при 96 000 g. Видимый визуально слой вируса обнаруживают в области плотностей 1,18—1,19 г/см3 и отбирают по фракциям (1 мл), начиная со дна пробирки. Сахарозу удаляют из вирусной суспензии либо хроматографией через сефадекс Г-50, либо с помощью осаждения вируса центрифугированием в течение 60 мин при 145 000 g и ресуспендирования осадка в буфере STE.

Источник: Вирусы гриппа и грипп, под ред. Кильбурн Э.Д — М.Медицина, 1978г.

Список использованной литературы:

Інструкція до застосування медичного препарату НАЗОФЕРОН; 2) «Аллергология и иммунлогия: национальное руководство» под. ред.. Р.М. Хаитова, Н.И. Ильиной – М.: ГЭОТАР-Медиа. 2009 г.; 3) Г.М. Драннік. Клінічна імунологія та алергологія. – Київ. «Здоров’я», 2006 р. 4) Наказ МОЗ України від 16.09.2011 № 595 «Про порядок проведення профілактичних щеплень в Україні та контроль якості й обігу медичних імунобіологічних препаратів»; 5) Г.В. Бекетова «Інтерферони в лікуванні гострих респіраторних інфекцій у дітей», журнал «Ліки України» № 3, (149), 2011 р.; 6) Шехтман М.М., Положенкова Л.А. Гострі респіраторні захворювання у вагітних / / Гінекологія. – 2005. – Т. 7. – № 2. – С. 34-37; 7)Приступа, Л.Н. Грип та гострі респіраторні вірусні інфекції у вагітних: Особливості Лікування та профілактики / / Медичні аспекти здоров’я жінки. – 2008. – № 5 (14). – С. 14-19; 8) Тарбаева Д.А., Костинов М.П., Загородня Е.Д., Іозефсон С.А., Черданцев А.П.Акушерскі і перинатальні наслідки вагітності, ускладненої гострою респіраторною інфекцією в II триместрі гестації / / Журнал “Акушерство і гінекологія.” – 2012. – № 2; 9) С.О.Крамарєв, д.м.н., професор В.В. Євтушенко «Оцінка ефективності рекомбінантного інтерферону альфа для лікування та профілактики гострих респіратоних вірусних інфекцій у дітей», журнал «Здоров’я України», № 18/1, 2008 р.; 10) А.А.Ярилин. Імунологія. Підручник. Москва. «Геогар-медіа». 2010 р.; 11) О.М. Біловол, П.г. Кравчун, В.Д. Бабаджан. «Клінічна імунологія та алергологія». Навчальний посібник медичних ВНЗ IV рівня акредитації та медичних факультетів університетів. Харків. «Гриф», 2011 р.; 12) С.О. Крамарєв, О.В. Виговська, О.Й. Гриневич «Обгрунтування застосування препаратів інтерферону при гострих респіраторних інфекціях у дітей», журнал «Клінічна імунологія. Алергологія. Інфектологія. 2007. № 10.»; 13) Є.І. Юліш, д.м.н. професор О.Є. Чернишева, Ю.А. Сорока «Інтерферонотерапія при ГРВІ і дітей», журнал «Здоров’я України» № 1(16), березень 2011 р.; 14С.П. Кривопустов «Інтаназальне використання інтраназального інтерферону альфа в педіатрії», журнал «Здоров’я України № 1, квітень 2010 р.»; 14) Лікування гострих респіраторних вірусних інфекцій у дітей, які часто хворіють: прості відповіді на складні запитання. Л.В. Беш, О.І. Мацюра, Львівський національний медичний університет ім. Данила Галицького, Львівський міський дитячий алергологічний центр. 2012 р.; 15) Діти, які часто хворіють: дискусійні питання і можливості їх вирішення. Л.В. Беш, Львівський національний медичний університет ім. Данила Галицького, Львівський міський дитячий алергологічний центр. 2011 р.; 16) Назоферон – на варті здоров’я у дітей. А.П. Волосовець. 2010 р.; 17) Наказ МОЗ України від 07.11.2009 № 814 "Про затвердження Клінічного протоколу діагностики та лікування у дітей пандемічного грипу, спричиненого вірусом (А H1/N1 Каліфорнія)"; 18) Наказ МОЗ України від 13.11.2009 № 832 "Про внесення змін до наказу МОЗ від 20.05.2009 №189-Адм „Про затвердження „Протоколу діагностики та лікування нового грипу А H1/N1 Каліфорнія) у дорослих"; 19) Наказ МОЗ України від 09.07.2004 № 354 Про затвердження Протоколів діагностики та лікування інфекційних хвороб у дітей; 20) Наказ МОЗ України від 21.04.2005 № 181 Про затвердження Протоколів надання медичної допомоги дітям за спеціальністю "дитяча отоларингологія"; 21) Наказ МОЗ України від 03.07.2006 № 433 Про затвердження протоколів надання медичної допомоги за спеціальністю „Пульмонологія"; 22) Наказ МОЗ України від 13.01.2005 № 18 Про затвердження Протоколів надання медичної допомоги дітям за спеціальністю "дитяча пульмонологія"; 23) Наказ МОЗ України від 09.07.2004 № 355 Про затвердження Протоколів лікування дітей за спеціальністю "Дитяча імунологія"; 24) Грип у дітей. О. К. Александрова. Посібник для лікарів та учнів медичних ВУЗІВ. Краснодар 2008; 25) ЗАГАЛЬНА БІОЛОГІЯ І МІКРОБІОЛОГІЯ ОСНОВИ ВІРУСОЛОГІЇ ОСОБЛИВОСТІ РЕПРОДУКЦІЇ ВІРУСІВ. Навчальний посібник для модульно-рейтингової технології навчання. С.В. Лаптєв, Н.І. Мезенцева. Бійськ 2005.; 26) Особливості харчування вагітних і жінок у період лактації. Н.А. Коровіна, Н.М. Подзолкова, І.М. Захарова. Москва 2008; 27) «Тиждень за тижнем». Сучасний довідник для майбутніх мам. Бердникова О.В. Москва 2007; 28) МЕДСЕСТРИНСТВО ПРИ ІНФЕКЦІЙНИХ ХВОРОБАХ. М.А. Андрейчин. О.Л. Івахів. Тернопіль, «Укрмедкнига», 2002 р.; 29) Вакцинація дитини. Краще запобігти, ніж захворіти. Інформація для батьків ©UNICEF/UKRAINE/2010/G.Pirozzi; 30) МЕДСЕСТРИНСТВО В ТЕРАПІЇ. За загальною редакцією проф. М.І. Шведа та проф. Н.В. Пасєчко. Тернопіль..