Культивування і очистка вірусів грипу

Grypp_ru2

Існує кілька різних методів очистки вірусів грипу. Описаний тут метод постійно використовується в нашій лабораторії, а також, з невеликими модифікаціями, в деяких інших наукових групах. Метод однаково придатний для очистки вірусу, культивованого як на курячих ембріонах, так, і на монослойной культурі фібробластів курячого ембріона (CEF). Крім того, за допомогою цього методу отримують препарати вірусу високого ступеня чистоти з 40% виходом щодо початкової кількості віріонів при дуже невеликої втрати інфекційне та гемагглютинирующей активності. В даний час описані і інші методи очистки (зокрема, з використанням для осадження сульфату амонію), за допомогою яких також отримують вірусні препарати високої чистоти, однак висока ‘концентрація солі, використовувана в цих методах, надає небажана дія на інфекційність віріонів. Необхідно відзначити, що основна вимога до описаних тут методикам, полягало в мінімальному впливі на інфекційність вірусу.

У більшості біохімічних робіт, виконаних на вірусах грипу США, в якості об’єкта дослідження використовували штам WSN. В Європі ж увага зосередилася на вивченні FPV, іншого штаму вірусу грипу А. Відмінності між цими двома штамами (зокрема, в нуклеїнових кислотах та їх реплікації), ймовірно, не особливо великі.

Штам WSN зазвичай культивується на первинній культурі фібробластів курячих ембріонів (CEF). Для отримання великих кількостей вірусу [порядка 5-Ю10-10-Ю10 бляшкообразующіх одиниць (БОЮ)] 40-60 суцільних монослоев інокуліруют з вірусом з множинністю зараження приблизно 5-Ю “” 5 БОЮ на клітку. Монослои инкубируют при 37 ° С протягом 40 год в атмосфері 5% СО2 (Simpson, Hirst, 1961), і вірус виділяють з сулернатанта за методикою, описаної далі. Для отримання радіоактивно міченого вірусу в систему безпосередньо перед інкубацією при 37 ° С додають потрібні ізотопи, зазвичай [3Н] -5-уридин (2- 5 мкКі / мл) або [3Н] -або, [14С] -амінокислоти (2-4мкКі / мл).

Після обробки РНК-азой вірус напластовують поверх 4 мл 30% сахарози в буфері STE і центрифугують протягом 1 год при 145 000 g. До осаду додають буфер STE, суміш гомогенізують для того, щоб повністю ресуслендіровать вірус, і центрифугують для видалення дебриса на малій швидкості. Сулернатант напластовують на лінійний градієнт сахарози (по 10 мл 30-60% сахарози в буфері STE), покритий шаром мінерального масла (10 мл) і центрифугують до рівноваги протягом 17 год при 96 000 g. Відомий візуально шар вірусу виявляють в області плотностей 1,18-1,19 г / см3 і відбирають по фракціям (1 мл), починаючи з дна пробірки. Сахарозу видаляють з вірусної суспензії або хроматографією через сефадексе Г-50, або за допомогою осадження вірусу центрифугированием протягом 60 хв при 145 000 g і ресуспендування осаду в буфері STE.

Джерело: Віруси грипу та грип, під ред. Кільбурн Е.Д – М.Медицина, 1978р.

Список використаної літератури:

Інструкція до застосування медичного препарату НАЗОФЕРОН; 2) «Аллергология и иммунлогия: национальное руководство» под. ред.. Р.М. Хаитова, Н.И. Ильиной – М.: ГЭОТАР-Медиа. 2009 г.; 3) Г.М. Драннік. Клінічна імунологія та алергологія. – Київ. «Здоров’я», 2006 р. 4) Наказ МОЗ України від 16.09.2011 № 595 «Про порядок проведення профілактичних щеплень в Україні та контроль якості й обігу медичних імунобіологічних препаратів»; 5) Г.В. Бекетова «Інтерферони в лікуванні гострих респіраторних інфекцій у дітей», журнал «Ліки України» № 3, (149), 2011 р.; 6) Шехтман М.М., Положенкова Л.А. Гострі респіраторні захворювання у вагітних / / Гінекологія. – 2005. – Т. 7. – № 2. – С. 34-37; 7)Приступа, Л.Н. Грип та гострі респіраторні вірусні інфекції у вагітних: Особливості Лікування та профілактики / / Медичні аспекти здоров’я жінки. – 2008. – № 5 (14). – С. 14-19; 8) Тарбаева Д.А., Костинов М.П., Загородня Е.Д., Іозефсон С.А., Черданцев А.П.Акушерскі і перинатальні наслідки вагітності, ускладненої гострою респіраторною інфекцією в II триместрі гестації / / Журнал “Акушерство і гінекологія.” – 2012. – № 2; 9) С.О.Крамарєв, д.м.н., професор В.В. Євтушенко «Оцінка ефективності рекомбінантного інтерферону альфа для лікування та профілактики гострих респіратоних вірусних інфекцій у дітей», журнал «Здоров’я України», № 18/1, 2008 р.; 10) А.А.Ярилин. Імунологія. Підручник. Москва. «Геогар-медіа». 2010 р.; 11) О.М. Біловол, П.г. Кравчун, В.Д. Бабаджан. «Клінічна імунологія та алергологія». Навчальний посібник медичних ВНЗ IV рівня акредитації та медичних факультетів університетів. Харків. «Гриф», 2011 р.; 12) С.О. Крамарєв, О.В. Виговська, О.Й. Гриневич «Обгрунтування застосування препаратів інтерферону при гострих респіраторних інфекціях у дітей», журнал «Клінічна імунологія. Алергологія. Інфектологія. 2007. № 10.»; 13) Є.І. Юліш, д.м.н. професор О.Є. Чернишева, Ю.А. Сорока «Інтерферонотерапія при ГРВІ і дітей», журнал «Здоров’я України» № 1(16), березень 2011 р.; 14С.П. Кривопустов «Інтаназальне використання інтраназального інтерферону альфа в педіатрії», журнал «Здоров’я України № 1, квітень 2010 р.»; 14) Лікування гострих респіраторних вірусних інфекцій у дітей, які часто хворіють: прості відповіді на складні запитання. Л.В. Беш, О.І. Мацюра, Львівський національний медичний університет ім. Данила Галицького, Львівський міський дитячий алергологічний центр. 2012 р.; 15) Діти, які часто хворіють: дискусійні питання і можливості їх вирішення. Л.В. Беш, Львівський національний медичний університет ім. Данила Галицького, Львівський міський дитячий алергологічний центр. 2011 р.; 16) Назоферон – на варті здоров’я у дітей. А.П. Волосовець. 2010 р.; 17) Наказ МОЗ України від 07.11.2009 № 814 "Про затвердження Клінічного протоколу діагностики та лікування у дітей пандемічного грипу, спричиненого вірусом (А H1/N1 Каліфорнія)"; 18) Наказ МОЗ України від 13.11.2009 № 832 "Про внесення змін до наказу МОЗ від 20.05.2009 №189-Адм „Про затвердження „Протоколу діагностики та лікування нового грипу А H1/N1 Каліфорнія) у дорослих"; 19) Наказ МОЗ України від 09.07.2004 № 354 Про затвердження Протоколів діагностики та лікування інфекційних хвороб у дітей; 20) Наказ МОЗ України від 21.04.2005 № 181 Про затвердження Протоколів надання медичної допомоги дітям за спеціальністю "дитяча отоларингологія"; 21) Наказ МОЗ України від 03.07.2006 № 433 Про затвердження протоколів надання медичної допомоги за спеціальністю „Пульмонологія"; 22) Наказ МОЗ України від 13.01.2005 № 18 Про затвердження Протоколів надання медичної допомоги дітям за спеціальністю "дитяча пульмонологія"; 23) Наказ МОЗ України від 09.07.2004 № 355 Про затвердження Протоколів лікування дітей за спеціальністю "Дитяча імунологія"; 24) Грип у дітей. О. К. Александрова. Посібник для лікарів та учнів медичних ВУЗІВ. Краснодар 2008; 25) ЗАГАЛЬНА БІОЛОГІЯ І МІКРОБІОЛОГІЯ ОСНОВИ ВІРУСОЛОГІЇ ОСОБЛИВОСТІ РЕПРОДУКЦІЇ ВІРУСІВ. Навчальний посібник для модульно-рейтингової технології навчання. С.В. Лаптєв, Н.І. Мезенцева. Бійськ 2005.; 26) Особливості харчування вагітних і жінок у період лактації. Н.А. Коровіна, Н.М. Подзолкова, І.М. Захарова. Москва 2008; 27) «Тиждень за тижнем». Сучасний довідник для майбутніх мам. Бердникова О.В. Москва 2007; 28) МЕДСЕСТРИНСТВО ПРИ ІНФЕКЦІЙНИХ ХВОРОБАХ. М.А. Андрейчин. О.Л. Івахів. Тернопіль, «Укрмедкнига», 2002 р.; 29) Вакцинація дитини. Краще запобігти, ніж захворіти. Інформація для батьків ©UNICEF/UKRAINE/2010/G.Pirozzi; 30) МЕДСЕСТРИНСТВО В ТЕРАПІЇ. За загальною редакцією проф. М.І. Шведа та проф. Н.В. Пасєчко. Тернопіль..